溶酶體（Lysosome）是細胞內含有多種水解酶的細胞器，是細胞內分解、降解細胞垃圾和細胞內過程中產生的廢物的主要場所。它在細胞的代謝過程、免疫應答、信號傳導等多個生理過程中發揮著關鍵作用。多項研究證實，人類的多種疾病發生可能與溶酶體相關機制有關，例如動脈粥樣硬化、神經退行性疾病、胰腺炎、自身免疫性疾病、溶酶體貯積癥和癌癥等，對這些機制的深入了解有助于研究靶向溶酶體的治療方法。

為了研究溶酶體相關基因功能，通常需要借助CRISPR基因編輯技術。美國密歇根大學李明教授課題組利用CRISPR/Cas9 技術在全基因組水平篩選到可以通過影響溶酶體功能阻礙RNF152降解的基因TMEM251[1]；Kivanc等通過CRISPR文庫進行unbiased的代謝基因篩選，得到了與溶酶體pH環境相關的兩個重要代謝通路——膽固醇合成以及鐵攝取[2]。接下來，小源將以近期發表在Cell期刊的研究為例，帶大家用CRISPR基因編輯技術打開溶酶體在帕金森癥研究中的新思路。

(資料圖片)

【CRISPR/Cas9基因編輯TMEM175，探索其與帕金森癥發病關聯】

浙工大團隊以Parkinson’s Disease-Risk Protein TMEM175 is a Proton-Activated Proton Channel in Lysosomes為題在Cell上發文，該研究發現帕金森癥的風險基因TMEM175是定位于溶酶體的氫離子激活的氫離子通道，其突變可能是誘發帕金森癥的關鍵因素之一[3]。

TMEM175被鑒定為一個K+通道，介導溶酶體和內體膜上的鉀傳導，從而調節RAW 小鼠巨噬細胞中溶酶體膜電位和pH。為了確定TMEM175是否在神經元來源的細胞中具有類似的功能，研究者使用CRISPR/Cas9技術在SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞系中做TMEM175的敲除(圖2A)[4]。研究發現，在含有10%血清的培養基中，TMEM175 KO SH-SY5Y的溶酶體pH值略高于WT。在Earle平衡鹽溶液(EBSS)中培養3小時后，溶酶體pH值顯著增加，而WT SH-SY5Y細胞在兩種培養條件下保持溶酶體pH值未顯著變化(圖2B)。考慮到TMEM175在溶酶體中會在多個組織中普遍表達。在營養培養和寡營養培養條件下，TMEM175 KO細胞中溶酶體天冬氨酸蛋白酶(CTSD)和半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B (CTSB)的蛋白水平與WT相比均顯著降低(圖2D)，溶酶體功能產生障礙。在TMEM175的 KO細胞中，也觀察到溶酶體相關膜糖蛋白1 (LAMP1)的遷移速度比WT更快，這可能是通過去糖基化或蛋白水解裂解導致的(圖2D)。TMEM175 KO沒有改變LAMP1+溶酶體的數量(圖2C)。對這些溶酶體酶活性的進一步評估顯示，與WT相比，TMEM175 KO的CTSD、CTSB和另一種與帕金森癥相關的溶酶體水解酶GBA顯著減少20-30%(圖2E-G)。寡營養培養沒有進一步顯示WT和KO之間酶活性的降低程度。與WT相比，KO中L-Homopropargylglycine (HPG)標記的蛋白質降解率降低(圖2H)。

為了確定TMEM175是否在α-突觸核蛋白聚集中發揮作用，研究者在大鼠海馬神經元細胞中用shRNA 干擾TMEM175，再通過免疫細胞化學和WB評估它們磷酸化的α-突觸核蛋白表達量(圖2A)。在14d和21 d培養時，TMEM175表達量降低了75-80%(圖2B)。經PFF處理的TMEM175-KD神經元細胞中，磷酸化α-突觸核蛋白染色顯著增加 2-3倍(圖2C和圖2D)，21d增加倍(圖2G和H)。PFF處理后14天，TMEM175-KD神經元的健康細胞核數量或代謝活性評估的細胞活力沒有變化(圖2E)。PFF后21天，存活細胞減少(圖2I)，可能導致磷酸化α-突觸核蛋白比PFF后14天減少了1倍。重要的是，與對照神經元相比，TMEM175的敲低導致α-突觸核蛋白聚集傾向增加，這是α-突觸核蛋白病和帕金森癥發展的關鍵因素。

研究人員在大鼠神經元模型系統中研究了TMEM175的功能。研究證實，TMEM175缺乏導致溶酶體pH不穩定，從而進一步導致溶酶體催化活性降低，葡萄糖腦苷酶活性降低，溶酶體對自噬體的清除受損，線粒體呼吸減少。此外，大鼠原代神經元TMEM175缺失導致外源性α-突觸核蛋白原纖維易感性增加。在α-突觸核蛋白原纖維處理后，發現缺乏TMEM175的神經元磷酸化和洗滌劑不溶性α-突觸核蛋白沉積增加。綜上所述，TMEM175在溶酶體和線粒體功能以及帕金森癥發病機制中起著直接的關鍵作用，并突出了該離子通道作為治療帕金森癥的潛在治療靶點。

參考文獻：

[1]?Zhang W, Yang X, Li Y, et al. GCAF (TMEM251) regulates lysosome biogenesis by activating the mannose-6-phosphate pathway[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 5351.

[2]?Weber RA et al. Maintaining Iron Homeostasis Is the Key Role of?LysosomalAcidity for Cell Proliferation. Molecular Cell. (2020) 7, 645-655.

[3]?Hu M, Li P, Wang C, et al. Parkinson’s disease-risk protein TMEM175 is a proton-activated proton channel in lysosomes[J]. Cell, 2022, 185(13): 2292-2308. e20.

[4]?Jinna S PE et al. TMEM175 deficiency impairs lysosomal and mitochondrial function and increases α-synuclein aggregation[J]. PANS. (2017)26: 114?(9)?2389-2394.